Multilocus Sequenz Typisierung ist eine Technik in der Molekularbiologie zur Typisierung von mehreren Loci. Das Verfahren charakterisiert Isolate von mikrobiellen Spezies unter Verwendung der DNA-Sequenzen der internen Fragmente mehrerer Haushaltsgenen. Etwa 450-500 bp interne Fragmente von jedem Gen verwendet werden, da diese genau an beiden Strängen unter Verwendung eines automatischen DNA-Sequenzierer sequenziert werden. Für jedes Haushaltsgens werden die verschiedenen in einer Bakterienspezies vorhandenen Sequenzen als unterschiedliche Allele zugeordnet und für jeden zu isolieren, die Allele an jedem der Loci definieren die Allel-Profil oder Sequenztyp.

Die erste MLST Schema zu entwickeln war für Neisseria meningitidis, dem Erreger der Meningokokken-Meningitis und Septikämie. Seit ihrer Einführung für die Erforschung von Evolutionsgeschichte hat MLST nicht nur für die menschliche Krankheitserreger, sondern auch für Pflanzenpathogene eingesetzt. Um das Sammeln und die Formatierung der verwendeten Sequenzen ein einfaches und kostenloses Plug-in für Firefox entwickelt worden, zu unterstützen.

Prinzip der MLST

MLST misst direkt die DNA-Sequenzvariationen in einer Reihe von Haushaltsgenen und charakterisiert Stämme durch ihre einzigartige allelische Profile. Das Prinzip der MLST ist einfach: Die Technik beinhaltet die PCR-Amplifikation, gefolgt von DNA-Sequenzierung. Nukleotidunterschiede zwischen Stämmen kann mit einer variablen Anzahl von Genen in Abhängigkeit von dem Unterscheidungsgrad gewünscht kontrolliert werden.

Der Arbeitsablauf des MLST beinhaltet: 1) Datensammlung, 2) Datenanalyse und 3) Multilocus Sequenzanalyse. Im ersten Abschnitt wird definitive Identifizierung Variation durch Bestimmung der Nucleotidsequenz der Genfragmente erhalten. In der Datenanalyse sind alle einzigartig Sequenzen Allel-Nummern in ein Allel-Profil zugeordnet und zusammengeführt und eine Sequenz zugeordnet. Wenn neue Allele und STs gefunden werden, werden sie in der Datenbank nach Überprüfung gespeichert. Im letzten Abschnitt des MLST die Verwandtschaft der Isolate werden durch den Vergleich allelische Profilen. Forscher tun, epidemiologische und phylogenetische Studien durch Vergleich STs von verschiedenen klonalen Komplexen. Während der Sequenzierung und Identifikationsprozess so bioinformatischen Techniken verwendet, um zu arrangieren, zu verwalten, zu analysieren und zu verschmelzen alle biologischen Daten ist eine riesige Menge von Daten erzeugt.

Um das Gleichgewicht zwischen dem akzeptablen Identifikationskraft, Zeit und Kosten für die Stammtypisierung zu schlagen, sind etwa sieben bis acht house-keeping-Gene häufig in den Laboratorien. Zitiert von Staphylococcus aureus als Beispiel werden sieben Haushaltsgenen in MLST Typisierung verwendet. Diese Gene sind Carbamat-Kinase, Shikimat Dehydrogenase, Glycerinkinase, Guanylatkinase, Phosphat-Acetyltransferase, Triosephosphatisomerase und Acetyl-Coenzym A-Acetyltransferase, wie durch die MLST Website angegeben. Jedoch ist es nicht unüblich, bis zu zehn Housekeeping-Genen verwendet werden. Für Vibrio vulnificus, sind die Haushaltsgene verwendet Glucose-6-Phosphat-Isomerase, DNA-Gyrase, B-Untereinheit, Malat-Lactat-Dehydrogenase, Methionyl-tRNA-Synthetase, phosphoribosylaminoimidazole Synthetase, Threonin-Dehydrogenase, Diaminopimelatdecarboxylase, Transhydrogenase alpha-Untereinheit, Dihydroorotase und Tryptophanase. Damit sowohl die Anzahl und Art der Housekeeping-Gene durch MLST verhört kann von Spezies zu Spezies unterscheiden.

Für jede dieser Haushaltsgenen, werden die verschiedenen Sequenzen als Allele zugewiesen, und die Allele an den Loci liefern eine allelische Profil. Eine Reihe von Profilen können dann die Identifikationsmarker für Stammtypisierung zu sein. Sequenzen, die auch nur ein einziges Nucleotid unterscheiden, werden als unterschiedliche Allele zugeordnet und keine Gewichtung gegeben wird auf Grund der Anzahl von Nukleotid-Unterschieden zwischen Allelen dauern, da wir nicht unterscheiden kann, ob die Unterschiede in mehreren Nukleotid Seiten sind ein Ergebnis von mehreren Punktmutationen oder einer einzigen rekombinatorische Austausch. Die große Anzahl von möglichen Allelen an jedem der Loci bietet die Möglichkeit, Milliarden von verschiedenen allelischen Profile zu unterscheiden und um einen Stamm mit der häufigsten Allele an jedem Locus würde voraussichtlich nur zufällig ungefähr einmal in 10.000 Isolaten auftreten. Trotz MLST, hohe Trennschärfe, ist die Ansammlung von Nukleotid-Veränderungen in der Haushaltsgene ein relativ langsamer Prozess und die Allel-Profil eines Bakterienisolat ist im Laufe der Zeit stabil genug für die Methode als ideal für die globale Epidemiologie.

Die Verwandtschaft der Isolate wird angezeigt als Dendrogramm mit der Matrix der paarweisen Unterschiede zwischen ihren allelische Profilen oder einem minimalen Spannbaum konstruiert. Dendrogramm ist nur eine bequeme Art der Anzeige dieser Isolate, das identisch oder sehr ähnlich allelische Profile, die angenommen werden kann, um von einem gemeinsamen Vorfahren abgeleitet werden müssen; die Beziehungen zwischen den Isolaten, die bei mehr als drei von sieben Loci unterschiedlich sind wahrscheinlich unzuverlässig zu sein und nicht als Einschränkung ihres phylogeny abzuleiten. Die MST verbindet alle Proben in einer Weise, dass die summierte Abstand von allen Zweigen des Baumes ist minimal.

Alternativ kann die Verwandtschaft der Isolate auch multilocus Sequenzanalyse analysiert werden. Dies bedeutet nicht, verwenden Sie die zugewiesenen Allele, sondern verkettet die Sequenzen der Genfragmente der Housekeeping-Gene und nutzt diese verketteten Sequenz, um Verwandtschaftsverhältnisse zu bestimmen. Im Gegensatz zu MLST geht diese Analyse zuweisen eine höhere Ähnlichkeit zwischen Sequenzen, die sich nur ein einziges Nukleotid und einem unteren Ähnlichkeit zwischen Sequenzen mit mehreren Nukleotid-Unterschiede. Als Ergebnis ist diese Analyse geeigneter für Organismen, klonaler Evolution und für Organismen, in denen Rekombinationsereignisse auftreten, sehr oft weniger geeignet. Es kann auch verwendet werden, um phylogenetischen Beziehungen zwischen eng verwandten Arten zu bestimmen. Die Begriffe MLST und MLSA werden sehr oft als austauschbar betrachtet. Dies ist jedoch nicht richtig, da jeder Analysemethode hat ihre Besonderheiten und Anwendungen. Es sollte darauf geachtet, um den richtigen Begriff zu verwenden.

Vergleich mit anderen Techniken

Zuvor hatte die serologische Typisierung Ansätze zur Differenzierung Bakterienisolate etabliert, aber immunologische Typisierung hat Nachteile, wie beispielsweise die Abhängigkeit von wenigen antigenen Loci und unberechenbar Reaktivitäten von Antikörpern mit unterschiedlichen Antigenvarianten. Mehrere molekulare Typisierung Schemata vorgeschlagen worden, um die Verwandtschaft von Pathogenen wie Pulsfeld-Gelelektrophorese Ribotypisierung und PCR-basierte Fingerabdrucks bestimmen. Aber diese DNA-Banding-basierte Typisierungsmethoden bieten keine sinnvolle evolutionäre Analysen. Trotz PFGE von vielen Forschern als der "Goldstandard" betrachtet wird, sind viele Stämme nicht typisierbaren durch diese Technik aufgrund der Degradation der DNA während des Prozesses.

Der Ansatz der MLST unterscheidet sich von Multi-Locus-Enzym-Elektrophorese, die auf verschiedenen elektrophoretischen Mobilitäten von mehreren Kernstoffwechselenzyme beruht. Die Allele an jedem Locus definieren die EM ihrer Produkte, wie unterschiedliche Aminosäuresequenzen zwischen Enzymen ergeben unterschiedliche Mobilitäten und distinkte Banden, wenn sie auf einem Gel laufen gelassen. Die Verwandtschaft der Isolate können dann mit einem Dendrogramm aus der Matrix der paarweisen Differenzen zwischen den elektrophoretischen Typen erzeugt visualisiert werden. Dieses Verfahren weist eine geringere Auflösung als MLST aus mehreren Gründen, die alle aus der Tatsache, daß die enzymatische Phänotyp Vielfalt lediglich ein Proxy für die DNA-Sequenzdiversität. Erstens können Enzyme unterschiedliche Aminosäuresequenzen haben, ohne ausreichend verschieden EM deutliche Banden zu ergeben. Sekunde "stille Mutationen" kann die DNA-Sequenz eines Gens ohne Veränderung der kodierten Aminosäuren verändern. Drittens kann der Phänotyp des Enzyms leicht als Reaktion auf Umweltbedingungen verändert werden und schlecht beeinflussen die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse MLEE - gemeinsamen Abänderungen von Enzymen sind Phosphorylierung, Cofaktor-Bindung und Spaltung von Transportsequenzen. Dies schränkt auch die Vergleichbarkeit der MLEE Daten durch verschiedene Labors erhalten, während MLST bietet portable und vergleichbare DNA-Sequenzdaten und hat ein großes Potenzial für die Automatisierung und Standardisierung.

MLST ist nicht zu verwechseln mit DNA Barcoding sein. Das letztere ist ein Verfahren, das taxonomische kurzen genetische Marker verwendet, um bestimmte Arten von Eukaryonten zu erkennen. Es basiert auf der Tatsache, dass die mitochondriale DNA oder einige Teile der ribosomalen DNA-Cistron relativ schnell Mutationsraten, die erhebliche Unterschiede in den Sequenzen zwischen den Arten geben basiert. mtDNA Methoden sind nur in Eukaryoten möglich, während MLST, obwohl zunächst für Prokaryoten entwickelt, findet jetzt Anwendung in Eukaryonten und im Prinzip könnte jeder Reich aufgetragen werden.

Vorteile und Anwendungen

MLST ist sehr eindeutige und tragbar. Für ST-Bestimmung erforderlichen Materialien können zwischen Laboratorien ausgetauscht werden. Primer-Sequenzen und Protokolle können elektronisch abgerufen werden. Es ist reproduzierbar und skalierbar. MLST ist automatisiert, kombiniert Fortschritte in der Hochdurchsatz-Sequenzierung und Bioinformatik mit etablierten Techniken der Populationsgenetik. MLST Daten können verwendet werden, um evolutionäre Beziehungen zwischen Bakterien zu untersuchen. MLST eine gute Trennschärfe, um Isolate zu unterscheiden.

Die Anwendung der MLST ist riesig und bietet eine Ressource für die wissenschaftliche, öffentliche Gesundheit, und Tiergemeinschaften sowie die Lebensmittelindustrie. Die folgenden Beispiele zeigen MLST-Anwendungen.

Campylobacter

Campylobacter ist die gemeinsame Erreger bakterieller Infektionsdarmerkrankungen, in der Regel aus ungekochten Geflügel oder Rohmilch. Allerdings ist seine Epidemiologie schlecht verstanden, da Ausbrüche selten erfaßt, so daß die Quellen und Übertragungswege des Ausbruchs werden nicht leicht zurückverfolgt. Außerdem sind Campylobacter Genome genetisch diversen und instabil bei häufiger inter- und intragenomischen Rekombination mit Phasenänderung, die die Interpretation von Daten aus vielen Typisierungsverfahren verkompliziert. Bis vor kurzem mit der Anwendung der MLST-Technik, Campylobacter Typisierung hat einen großen Erfolg erreicht und auf die MLST Datenbank hinzugefügt. Zum 1. Mai 2008 enthält die Campylobacter MLST-Datenbank 3516 Isolate und etwa 30 Publikationen, die zu nutzen oder zu erwähnen MLST in der Forschung über Campylobacter.

Neisseria meningitidis

MLST hat eine reich strukturierte Bild von Bakterien in menschlichen Populationen und auf Stammvarianten, die pathogen Mensch, Pflanzen und Tiere sein kann. MLST Technik wurde zuerst von Jung et al. um Neisseria meningitidis mit sechs Loci zu charakterisieren. Die Anwendung der MLST hat deutlich die wichtigsten Meningokokken-Linien bekannt für invasive Erkrankungen auf der ganzen Welt verantwortlich zu sein behoben. Zur Verbesserung der Ebene der Trennschärfe zwischen den großen invasive Linien werden sieben Loci nun verwendet, und wurde von vielen Labors als die Methode der Wahl für die Charakterisierung von Meningokokken-Isolate angenommen haben. Es ist eine wohlbekannte Tatsache, dass Rekombinationsereignisse Austausch treten häufig in N. meningitidis, was zu einem raschen Diversifizierung von Meningokokken Klonen. MLST hat erfolgreich eine zuverlässige Methode zur Verfügung gestellt für die Charakterisierung von Klonen in anderen Bakterienarten, in denen die Preise der klonalen Diversifizierung sind in der Regel niedriger.

Staphylococcus aureus

S. aureus verursacht eine Reihe von Krankheiten. Methicillin-resistente S. aureus hat die wachsende Besorgnis erzeugt über seine Beständigkeit gegen fast alle Antibiotika außer Vancomycin. Jedoch schwerste Infektionen durch S. aureus in der Gemeinschaft, und viele in Krankenhäusern unter Methicillin-empfindlichen Isolate verursacht, und es wurden nur wenige Versuche, die hyper MSSA Klone mit ernsthaften Krankheiten assoziiert sind. MLST wurde daher entwickelt, um eine eindeutige Verfahren zur Charakterisierung MRSA Klonen und zur Identifizierung der Klone mit MSSA ernste Krankheit verbunden sind.

Streptococcus pyogenes

S. pyogenes verursacht Krankheiten von Pharyngitis zu lebensbedrohlichen Impetigo einschließlich nekrotisierende Fasziitis. Ein MLST Schema für S. pyogenes wurde entwickelt. Derzeit enthält die Datenbank die Allel-Profile der Isolate, die die weltweite Vielfalt des Organismus darstellen und Isolate von schweren invasiven Erkrankungen.

Candida albicans

C. albicans ist ein Pilzpathogen von Menschen und ist für im Krankenhaus erworbene Infektionen Blutkreislauf verantwortlich. MLST Technik wurde verwendet, um C. albicans Isolate zu charakterisieren. Kombination der Allele an unterschiedlichen Loci entstehen einzigartige diploiden Sequenztypen, die verwendet werden, um Stämme zu unterscheiden. MLST wurde gezeigt, erfolgreich eingesetzt, um die Epidemiologie von C. albicans in der Klinik als auch die Vielfalt von C. albicans Isolate studieren aus unterschiedlichen ökologischen Nischen einschließlich menschlichen und tierischen Wirten.

Cronobacter

Die Cronobacter Gattung von 7 Arten. Vor dem Jahr 2007 wurde die einzige Spezies Name Enterobacter sakazakii, um diese Organismen angewandt. Die Cronobacter MLST wurde ursprünglich angewandt, um zwischen C. sakazakii und C. malonaticus zu unterscheiden, weil 16S rDNA-Sequenzierung ist nicht immer genau genug, und Biotypisierung ist zu subjektiv. Die Cronobacter MLST Schema verwendet 7 Allele; ATPD, Fusa, GLN, gltB, gyrB, INFB und ppsA was eine verkettete Sequenz von 3036 bp für phylogenetische Analyse und vergleichende Genomik. MLST hat auch in der formalen Anerkennung neuer Cronobacter Arten verwendet. Die Methode hat eine starke Assoziation zwischen einer genetischen Abstammungslinie, Sequenztyp 4 und Fälle von Neugeborenen-Meningitis ergab., Die Cronobacter MLST-Stelle am besten erscheint in populationsgenetische Untersuchung, aber es ist teuer. Aufgrund der Sequenzkonservierung in Haushaltsgenen, MLST manchmal fehlt die Trennschärfe, um Bakterienstämme zu unterscheiden, die ihren Einsatz in epidemiologischen Untersuchungen begrenzt. Um die Trennschärfe des MLST zu verbessern, wurde ein Multi-Virulenz-Locus-Sequenz Typisierung Ansatz mit Listeria monocytogenes entwickelt. MVLST erweitert die Vorteile der MLST sondern zielt Virulenzgene, die mehr polymorphe als Housekeeping-Gene sein können. Populationsgenetik ist nicht der einzige relevante Faktor bei einer Epidemie. Virulenzfaktoren sind auch bei der Entstehung von Krankheiten wichtig, und populationsgenetische Studien kämpfen, um diese zu überwachen. Das ist, weil die beteiligten Gene sind oft sehr Rekombination und Mobil zwischen Stämmen im Vergleich mit der populationsgenetischen Rahmen. So beispielsweise in Escherichia coli, ist die Identifikation tragenden Stämme Toxingene wichtiger als ein Populationsgenetik bezogene Auswertung vorherrschenden Stämme.

Das Aufkommen der zweiten Generation Sequenziertechnologien ist es möglich, Sequenzinformationen über die gesamte Bakteriengenom bei relativ geringen Kosten und Aufwand zu erhalten, hergestellt und MLST kann nun von Gesamtgenom-Sequenzinformationen zugeordnet werden, anstatt die Sequenzierung jeden Locus getrennt wie auch die üben, wenn MLST zuerst entwickelt wurde. Whole-Genom-Sequenzierung bietet umfassendere Informationen zur Differenzierung Bakterienstämme. Zum Beispiel Vollgenomsequenzierung zahlreicher Isolate hat ergeben, das einzelne MLST Linie ST258 von Klebsiella pneumoniae umfasst zwei unterschiedliche genetische Subtypen, die zusätzliche Informationen über die Entwicklung und Verbreitung dieser multiresistenten Organismen und widerlegen die bisherige Hypothese einer einzigen klonalen Herkunfts ST258.

MLST-Datenbanken

MLST-Datenbanken enthalten die Referenz Allelsequenzen und Sequenztypen für jeden Organismus, sowie epidemiologische Daten zu isolieren. Die Webseiten enthalten Abfrage- und Analyse-Software, die es Benutzern, ihre Allelsequenzen und Sequenztypen abfragen können. MLST wird weithin als ein Werkzeug für Forscher und den öffentlichen Gesundheitsbereich tätigen Arbeitnehmer verwendet.

Die Mehrheit der MLST-Datenbanken werden bei 2 Web-Server noch am Imperial College, London, und in Oxford University veranstaltet.

Die Datenbanken an jedem Standort gehostet sind anders und halten den Organismus spezifischen Referenz Allelsequenzen und Listen von M. für den einzelnen Organismen.