Affinitätschromatographie ist ein Verfahren zum Trennen von biochemischen Mischungen auf Basis von sehr spezifischer Interaktionen wie die zwischen Antigen und Antikörper, Enzym und Substrat oder Rezeptor und Ligand.

Verwendungen

Affinitätschromatographie kann verwendet werden:

• Reinigen und zu konzentrieren eine Substanz aus einer Mischung in eine Pufferlösung
• Verringerung der Menge einer Substanz in einer Mischung
• Unterscheiden, was biologische Verbindungen auf eine bestimmte Substanz zu binden,
• Reinigen und zu konzentrieren eine Enzymlösung.

Prinzip

Die stationäre Phase ist typischerweise eine Gelmatrix, die oft aus Agarose; eine lineare Zuckermolekül aus Algen gewonnen. In der Regel der Ausgangspunkt ist ein undefinierter heterogene Gruppe von Molekülen in Lösung, wie beispielsweise ein Zelllysat, Wachstumsmedium oder Blutserum. Das interessierende Molekül eine bekannte und definierte Eigenschaft zu haben, und kann während der Affinitätsreinigungsprozess ausgenutzt werden. Das Verfahren selbst kann als ein Einschluss betrachtet werden, wobei das Zielmolekül immer auf einem festen oder stationären Phase oder mittel gefangen. Die anderen Molekülen in der mobilen Phase wird nicht eingeklemmt werden, wenn sie diese Eigenschaft nicht besitzen. Die stationäre Phase kann dann aus der Mischung, gewaschen und das Zielmolekül aus dem Einschluss in einem Verfahren, wie Elution bekannt Freigabe entfernt werden. Vielleicht die häufigste Verwendung von Affinitätschromatographie zur Reinigung von rekombinanten Proteinen.

Batch und Spaltenaufbau

Bindung an die Festphase kann durch Säulenchromatographie, wobei das feste Medium wird auf eine Säule gepackt zuführen, daß die Ausgangsmischung durch die Säule laufen, um zu ermöglichen Umgebung, ein Waschpuffer durch die Säule und des Elutionspuffers laufen anschließend auf die Säule aufgetragen und aufgefangen . Diese Schritte werden in der Regel bei Umgebungsdruck durchgeführt. Alternativ Bindung, beispielsweise durch Zugabe der Ausgangsmischung in die feste Phase in einem Behälter, Mischen, Trennen der festen Phase, das Entfernen der flüssigen Phase kann unter Verwendung eines Batch-Behandlung erreicht werden, Waschen, erneut Zentrifugieren Zugabe des Elutionspuffers erneut Zentrifugieren und Entfernen des Eluats.

Manchmal ist ein Hybridverfahren verwendet wird, so dass die Bindung durch das Batch-Verfahren durchgeführt, aber die Festphase mit dem Zielmolekül gebunden ist, auf eine Säule aufgetragen und das Waschen und die Elution verpackt werden auf die Säule durchgeführt.

Ein drittes Verfahren, expandierten Bett-Adsorption, die die Vorteile der beiden oben erwähnten Methoden kombiniert, wurde ebenfalls entwickelt. Die feste Phase Partikel in einer Spalte, in der Flüssigphase von unten und tritt oben gepumpt platziert. Der Schwerpunkt der Partikel zu gewährleisten, dass die feste Phase nicht die Säule verlassen mit der flüssigen Phase.

Affinitätssäulen durch Ändern Salzkonzentrationen eluiert werden, pH, pI, Ladung und Ionenstärke direkt oder durch einen Gradienten, um die Teilchen von Interesse zu lösen.

Bestimmte Verwendungen

Affinitätschromatographie kann in einer Reihe von Anwendungen, einschließlich Nukleinsäurereinigung, Proteinreinigung von zellfreien Extrakten und Reinigung von Blut verwendet werden.

Immunaffinitäts

Eine weitere Verwendung für das Verfahren ist die Affinitätsreinigung von Antikörpern aus Blutserum. Wird Serum ist bekannt, dass Antikörper gegen ein spezifisches Antigen, dann kann es für die Affinitätsreinigung dieses Antigen verwendet werden, enthalten. Dies wird auch als Immunaffinitätschromatographie bekannt. Zum Beispiel, wenn ein Organismus gegen ein GST-Fusionsprotein immunisiert wird Antikörper gegen das Fusionsprotein, und möglicherweise Antikörper gegen das GST-Tag als auch zu produzieren. Das Protein kann dann kovalent an einen festen Träger, wie Agarose gekoppelt ist und als Affinitätsligand in Reinigungen der Antikörper aus Immunserum verwendet werden.

Gründlichkeit das GST-Protein und das GST-Fusionsprotein kann jeweils separat gekoppelt zu werden. Das Serum wird zunächst erlaubt, auf die GST-Affinitätsmatrix zu binden. Dies wird von Antikörpern gegen das GST Teil des Fusionsprotein zu entfernen. Das Serum wird dann von dem festen Träger abgetrennt und läßt auf die GST-Fusionsproteinmatrix binden. Hierdurch kann jeder Antikörper, die das Antigen erkennen, um auf dem festen Träger eingefangen werden. Elution der Antikörper von Interesse wird am häufigsten unter Verwendung eines Puffers mit niedrigem pH erreicht wird, wie Glycin pH 2,8. Das Eluat wird in einem neutralen Tris oder Phosphat-Puffer gesammelt, um den niedrigen pH-Elutionspuffer neutralisieren und halt keine Verschlechterung der Aktivität des Antikörpers. Dies ist ein gutes Beispiel, wie die Affinitätsreinigung verwendet wird, um die anfängliche GST-Fusionsprotein zu reinigen, um unerwünschte anti-GST-Antikörper aus dem Serum zu entfernen und den Zielantikörper zu reinigen.

Eine vereinfachte Strategie wird oft verwendet, um Antikörper gegen Peptid-Antigene erzeugt reinigen. Wenn die Peptidantigene, synthetisch hergestellt werden, wird ein Cysteinrest an entweder dem N- oder C-Terminus des Peptids hinzugefügt. Dieser Cysteinrest enthält eine Sulfhydryl funktionelle Gruppe, die das Peptid ermöglicht, leicht an ein Trägerprotein konjugiert werden). Die gleiche Cystein enthaltenden Peptid wird ebenfalls auf einem Agarose-Harz durch den Cysteinrest immobilisiert und wird dann verwendet, um den Antikörper zu reinigen.

Die meisten monoklonalen Antikörper wurden mittels Affinitätschromatographie auf Basis von Immunglobulin-spezifische Protein A oder Protein G, die von Bakterien abgeleitet sind, gereinigt.

Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie

Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie beruht auf der spezifischen Koordinaten kovalente Bindung von Aminosäuren, insbesondere Histidin, an Metalle. Diese Technik funktioniert, indem Proteine ​​mit einer Affinität für Metallionen, die in einer Säule, die immobilisierte Metallionen, wie Cobalt, Nickel, Kupfer für die Reinigung von Histidin, die Proteine ​​oder Peptide, Eisen, Zink oder Gallium für die Reinigung von phosphoryliertem beibehalten Proteine ​​oder Peptide. Viele natürlich vorkommende Proteine ​​haben keine Affinität für Metallionen daher rekombinante DNA-Technologie kann verwendet werden, um eine solche Protein-Tag in das entsprechende Gen einzuführen. Methoden, um das Protein von Interesse zu eluieren umfassen das Ändern des pH-Werts oder Zusatz eines wettbewerbsfähigen Molekül, wie Imidazol.

Rekombinanten Proteinen

Vielleicht die häufigste Verwendung von Affinitätschromatographie zur Reinigung von rekombinanten Proteinen. Proteine ​​mit einer bekannten Affinität sind Protein, um ihre Reinigung zu erleichtern markiert. Das Protein kann die genetisch modifiziert wurden, so wie es für Affinitätsbindung gewählt werden, um zu ermöglichen; dies wird als Fusionsprotein bekannt. Markierungen umfassen Glutathion-S-Transferase, Hexahistidin, und Maltose-bindendes Protein. Histidin-Sequenzen haben eine Affinität für die durch die koordinative kovalente Bindungen mit einem Chelator in der stationären Phase aufgenommen immobilisiert wurden Nickel- oder Kobaltionen. Zur Elution werden eine überschüssige Menge einer Verbindung in der Lage, als ein Metall-Ion-Ligand fungieren, wie Imidazol, verwendet wird. GST eine Affinität für Glutathion, kommerziell erhältlich als Glutathion-Agarose immobilisiert ist. Während der Elution wird überschüssiges Glutathion verwendet, um das markierte Protein zu verdrängen.

Lektine

Lectinaffinitätschromatographie ist eine Form der Affinitätschromatographie denen Lektine verwendet werden, um Komponenten in der Probe zu trennen. Lectine, wie Concanavalin A, sind Proteine, die spezifische Kohlenhydratmoleküle binden können. Die üblichste Anwendung ist die Glycoproteine ​​aus nicht-glycosylierten Proteinen oder einer Glykoform eines anderen Glykoform trennen.