Westlicher Fleck

FONT SIZE:

April 15, 2016 Irmina Schön W 0 19

Der Western-Blot ist eine weit verbreitete analytische Technik verwendet, um spezifische Proteine in einer Probe von Gewebe-Homogenat oder Extrakt zu detektieren. Es verwendet Gelelektrophorese, native Proteine durch 3-D-Struktur oder denaturierte Proteine durch die Länge des Polypeptids zu trennen. Anschließend werden die Proteine auf eine Membran, wo sie mit spezifisch für das Zielprotein-Antikörpern gefärbt übertragen. Die Gelelektrophorese Schritt wird in Western-Blot-Analyse eingeschlossen, um das Problem der Kreuzreaktivität von Antikörpern zu lösen.

Es gibt jetzt viele Reagenzien Unternehmen, die bei der Bereitstellung von Antikörpern gegen Zehntausende von verschiedenen Proteinen zu spezialisieren. Handelsübliche Antikörper kann teuer sein, obwohl das nicht gebundene Antikörper kann zwischen den Experimenten verwendet werden. Dieses Verfahren ist in den Gebieten der Molekularbiologie, Biochemie, Immunogenetics und andere molekularbiologische Disziplinen verwendet. Eine Reihe von Suchmaschinen, wie CiteAb, stehen zur Verfügung, die helfen können Forscher finden geeignete Antikörper zur Verwendung in der Western Blot.

Andere ähnliche Techniken schließen Dot-Blot-Analysen, Immunhistochemie und Immunzytochemie denen Antikörper verwendet werden, um Proteine, die in Geweben und Zellen zu detektieren durch Immunfärbung und Enzym-Immunoassay.

Die Methode stammt aus dem Labor von Harry Towbin am Friedrich-Miescher-Institut. Der Name Western-Blot wurde mit der Technik von W. Neal Burnette angegeben und ist ein Spiel auf dem Namen Southernblot, eine Technik zur DNA-Detektion früher von Edwin Southern entwickelt. Erkennung von RNA Northern Blot bezeichnet und wurde von George Stark an der Stanford entwickelt.

Schritte

Gewebepräparation

Proben können aus ganzem Gewebe oder von Zellkultur genommen werden. Festen Geweben werden zunächst nach unten mechanisch mit einem Mixer, mit einem Homogenisator oder durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Zellen können auch offen durch eine der oben genannten mechanischen Verfahren aufgebrochen werden. Jedoch kann Virus oder Umweltproben der Proteinquelle und somit Western Blot ist nicht nur auf Zellstudien beschränkt werden.

Verschiedene Reinigungsmittel, Salze und Puffer können verwendet werden, um die Lyse der Zellen zu fördern und die Proteine zu solubilisieren. Protease und Phosphatase-Inhibitoren werden oft hinzugefügt, um den Aufschluss der Probe durch einen eigenen Enzyme verhindern. Gewebepräparation wird oft bei niedrigen Temperaturen durchgeführt, um Protein-Denaturierung und Abbau zu vermeiden.

Eine Kombination von biochemischen und mechanischen Techniken - bestehend aus verschiedenen Arten von Filtration und Zentrifugation - können verwendet werden, um verschiedene Zellkompartimente und Organellen zu trennen.

Gelelektrophorese

Die Proteine der Probe werden unter Verwendung von Gelelektrophorese getrennt. Trennung von Proteinen durch isoelektrische Punkt, Molekulargewicht, die elektrische Ladung oder eine Kombination dieser Faktoren sein. Die Art der Trennung ist abhängig von der Behandlung der Probe und der Natur des Gels. Dies ist ein sehr nützlicher Weg, um ein Protein zu identifizieren.

Bei weitem die häufigste Form von Gel-Elektrophorese verwendet Polyacrylamidgelen und Puffer mit Natriumdodecylsulfat geladen. SDS-PAGE unterhält Polypeptiden in einem denaturierten Zustand, nachdem sie mit starken Reduktionsmitteln behandelt wurden, um sekundäre und tertiäre Struktur zu entfernen und ermöglicht somit die Trennung von Proteinen, deren Molekulargewicht. Abgetastet Proteine werden abgedeckt in den negativ geladenen SDS und zu bewegen, um den positiv geladenen Elektrode durch die Acrylamid-Mesh des Gels. Kleinere Proteine wandern schneller durch diese Gitter und die Proteine sind daher je nach Größe getrennt. Die Konzentration von Acrylamid bestimmt die Auflösung des Gels - je größer die Acrylamidkonzentration, desto besser ist die Auflösung des geringeren Molekulargewicht Proteine. Je niedriger die Acrylamidkonzentration, desto besser ist die Auflösung von höhermolekularen Proteinen. Proteine reisen nur in einer Dimension entlang der Gel für die meisten Blots.

Proben werden in die Vertiefungen in dem Gel geladen. Eine Fahrspur wird in der Regel für einen Marker oder einer Leiter, einem handelsüblichen Gemisch von Proteinen mit definiertem Molekulargewichte vorgesehen, typischerweise gefärbt, um sichtbar, farbige Streifen bilden. Wenn eine Spannung entlang der Gel aufgetragen, Proteine wandern durch sie mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von ihrer Größe. Diese unterschiedlichen Geschwindigkeiten der Weiterentwicklung zu trennen in Bänder in jeder Spur.

Es ist auch möglich, ein zweidimensionales Gel, das die Proteine aus einer einzigen Probe in zwei Dimensionen erstreckt sich zu verwenden. Proteine gemäß isoelektrischer Punkt in der ersten Dimension getrennt und nach ihrem Molekulargewicht in der zweiten Dimension.

Transfer

Um die Proteine zugänglich Antikörpernachweis zu machen, werden sie aus dem Gel auf eine Membran aus Nitrocellulose oder Polyvinylidendifluorid hergestellt bewegt werden. Das Hauptverfahren zum Übertragen der Proteine heißt Elektroblotting und verwendet einen elektrischen Strom, um Proteine aus dem Gel in die PVDF oder Nitrocellulose-Membran zu ziehen. Die Proteine bewegen aus dem Gel auf die Membran, während die Organisation, die sie innerhalb des Gels hatte. Eine ältere Methode der Übertragung geht darum, eine Membran auf der Oberseite des Gels, und einen Stapel von Filterpapieren obendrein. Der gesamte Stapel wird in einer Pufferlösung, die bis bewegt das Papier durch Kapillarwirkung, indem die Proteine mit sich gebracht. In der Praxis wird dieses Verfahren nicht verwendet werden, da es zu viel Zeit in Anspruch nimmt; Elektroblotting bevorzugt. Als Ergebnis der beiden Verfahren "Blotting", werden die Proteine auf eine dünne Oberflächenschicht zur Detektion ausgesetzt. Beide Sorten von Membran sind für ihre nicht-spezifische Proteinbindungseigenschaften ausgewählt. Protein Bindung wird auf hydrophoben Wechselwirkungen sowie geladene Wechselwirkung zwischen der Membran und auf Proteinbasis. Nitrocellulose-Membranen sind billiger als PVDF, sind aber weit mehr zerbrechlich und nicht gut stand wiederholt Sondierungen.

Die Einheitlichkeit und die Gesamteffektivität der Übertragung des Proteins aus dem Gel auf die Membran kann durch Färbung der Membran mit Coomassie Brilliant Blue oder Ponceau S Farbstoffe überprüft werden. Ponceau S ist die normalerweise von beiden, wegen ihrer höheren Empfindlichkeit und Wasserlöslichkeit, letzteres erleichtert die anschließend Entfärben und Sonde der Membran, wie nachstehend beschrieben.

Blockierung

Da die Membran für seine Fähigkeit, Protein binden und so beide Antikörper und dem Ziel ausgewählt worden sind Proteine, müssen Schritte unternommen werden, um die Wechselwirkungen zwischen der Membran und den Antikörper für den Nachweis des Zielproteins verwendet verhindern. Typischerweise 3-5% Rinderserum-Albumin oder fettfreie Trockenmilch in Tris-gepufferte Salzlösung oder I-Block, mit einem winzigen Anteil an Detergenz, - Blockierung der unspezifischen Bindung wird bestimmt, indem die Membran in einer verdünnten Lösung des Proteins erreicht wie Tween 20 oder Triton X-100. Das Protein in der verdünnten Lösung wird an der Membran an allen Orten, wo die Zielproteine nicht gebunden. Somit wird, wenn der Antikörper zugegeben wird, gibt es keinen Raum auf der Membran dafür auf anderen als den Bindestellen des spezifischen Zielproteins zu befestigen. Dies reduziert "Rauschen" in dem Endprodukt der Western-Blot, was zu klareren Ergebnisse und eliminiert Fehlalarme.

Erkennung

Während des Detektionsprozesses die Membran "sondiert" für das Protein von Interesse mit einem modifizierten Antikörper, der an ein Reporterenzym gebunden ist; wenn sie auf einem geeigneten Substrat ausgesetzt wird, dieses Enzym treibt eine Farbreaktion und erzeugt eine Farbe. Aus einer Vielzahl von Gründen ist dies traditionell in einem zweistufigen Verfahren stattfindet, obwohl es nun eine einstufige Detektionsverfahren für gewisse Anwendungen zur Verfügung.

Zwei Schritte

Primärantikörper

Die primären Antikörper werden erzeugt, wenn ein Host-Spezies oder Immunzellkultur zu Protein von Interesse ausgesetzt ist. Normalerweise ist dieser Teil der Immunantwort, wohingegen hier sie geerntet werden und wie sensitiven und spezifischen Nachweis-Tools, die das Protein direkt binden.

Nach der Blockierung wird eine verdünnte Lösung des primären Antikörpers mit der Membran unter leichtem Schütteln inkubiert. Typischerweise wird die Lösung von Kochsalzlösung mit einem kleinen Prozentsatz von Waschmittel mit Milchpulver oder BSA zusammengesetzt, und manchmal. Die Antikörperlösung und der Membran abgedichtet und zusammen zwischen 30 Minuten bis über Nacht inkubiert werden. Sie kann auch bei verschiedenen Temperaturen inkubiert werden, bei höheren Temperaturen mit mehreren Bindungs, sowohl spezifische als auch unspezifische verbunden.

Sekundären Antikörper

Nach Spülen der Membran, um ungebundenen primären Antikörper zu entfernen, wird die Membran zu einer anderen Antikörper ausgesetzt wird, bei einer speziesspezifischen Teil des primären Antikörpers gerichtet ist. Antikörper kommen aus tierischen Quellen; ein Anti-Maus Sekundär wird zu fast jeder Maus-sourced primären Antikörper, die einige Kosteneinsparungen ermöglicht, indem ein ganzes Labor auf eine einzige Quelle von serienmäßig hergestellten Antikörper zu teilen, und bietet weit mehr konsistente Ergebnisse zu binden. Dies wird als ein sekundärer Antikörper bekannt und aufgrund ihrer spezifischen Bindungseigenschaften, neigt dazu, als "Anti-Maus", "Anti-Ziege" usw. bezeichnet Der sekundäre Antikörper wird in der Regel an Biotin oder an ein Reporterenzym, wie beispielsweise verbunden werden alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase. Dies bedeutet, dass mehrere Sekundärantikörper wird auf eine primäre Antikörper zu binden und zu verbessern das Signal.

Am häufigsten wird ein Meerrettich-Peroxidase-gebundenen sekundären verwendet wird, um ein chemilumineszentes Agens zu spalten, und das Reaktionsprodukt produziert Lumineszenz im Verhältnis zur Menge des Proteins. Eine lichtempfindliche Blatt von photographischem Film wird gegen die Membran gelegt und die Belichtung mit dem Licht, der Reaktion erzeugt ein Bild der auf dem Blot gebundenen Antikörper. Ein billiger, aber weniger empfindlich Ansatz nutzt ein 4-Chlornaphthol Fleck mit 1% Wasserstoffperoxid; Reaktion Peroxidradikale mit 4-Chlornaphthol erzeugt eine dunkle purpurrote Flecken, die ohne die Verwendung von speziellen fotografischen Film fotografiert werden kann.

Wie bei den ELISPOT und ELISA-Verfahren kann das Enzym mit einem Substratmolekül, das durch das Enzym in ein gefärbtes Reaktionsprodukt, das auf der Membran sichtbar wird konvertiert werden bereitgestellt.

Eine andere Methode der sekundären Antikörper-Nachweis verwendet eine Nahinfrarot-Fluorophor-verknüpften Antikörper. Licht von der Anregung eines fluoreszierenden Farbstoff hergestellt ist statisch, so dass die Fluoreszenzdetektion eine genauere und genaues Maß für die Differenz in der durch markierte Antikörper gegen Proteine auf einem Western-Blot gebunden erzeugte Signal. Proteine können genau quantifiziert, da der durch die unterschiedlichen Mengen an Proteine auf den Membranen erzeugte Signal wird in einem statischen Zustand gemessen werden kann, im Vergleich zur Chemilumineszenz, bei dem Licht in einem dynamischen Zustand gemessen.

Eine dritte Alternative besteht darin, eine radioaktive Markierung, anstatt eines Enzyms an den sekundären Antikörper gekoppelten wie Etikettierung eines Antikörper-bindenden Proteins, wie etwa Staphylococcus Protein A oder Streptavidin, das mit einem radioaktiven Isotop von Iod verwendet werden. Da andere Verfahren sind sicherer, schneller und billiger ist, wird dieses Verfahren heute selten verwendet; ist jedoch ein Vorteil dieser Vorgehensweise ist die Empfindlichkeit der Autoradiographie basierten Bildgebung, die sehr genaue Quantifizierung von Proteinen ermöglicht, wenn sie mit optischen Software kombiniert.

Ein Schritt

Historisch wurde die Antastvorgang in zwei Schritten aufgrund der relativen Leichtigkeit der Herstellung primären und sekundären Antikörper in separaten Prozessen durchgeführt. Dies gibt Forschern und Unternehmen enorme Vorteile in Bezug auf Flexibilität und fügt ein Verstärkungsschritt an den Erkennungsprozess. Nachdem inzwischen die Hochdurchsatz-Proteinanalyse und der unteren Erfassungsgrenze, jedoch gab es Interesse an der Entwicklung einer einstufigen Antastsystemen die es ermöglicht, das Verfahren schneller auftreten, und mit weniger Verbrauchsmaterialien. Dies erfordert einen Sondenantikörper erkennt, die sowohl das Protein von Interesse enthält, und eine nachweisbare Markierung, Sonden, die häufig für bekannte Protein-Tags verfügbar sind. Die primäre Sonde mit der Membran in einer Weise ähnlich zu der für den primären Antikörper, der in einem zweistufigen Verfahren inkubiert und dann ist zur direkten Detektion nach einer Reihe von Waschschritten.

Auswertung

Nachdem die ungebundenen Sonden weggewaschen werden, ist der Western-Blot bereit zum Nachweis von Sonden, die gekennzeichnet sind und die an das Protein von Interesse gebunden ist. In der Praxis werden nicht alle Western offenbaren Protein nur an einem Band in einer Membran. Größe Approximationen durch Vergleich der gefärbten Banden zu der des Markers oder Leiter während der Elektrophorese geladen gemacht. Der Prozess wird im Allgemeinen für ein Strukturprotein, wie Actin oder Tubulin, die nicht zwischen den Proben ändern sollte wiederholt. Die Menge an Zielprotein ist normiert auf das Strukturprotein zwischen Gruppen zu steuern. Eine überlegene Strategie ist die Normierung auf die Gesamtprotein mit Trichlorethanol oder Epicocconon visualisiert. Dadurch wird sichergestellt, Korrektur für die Menge an Gesamtprotein auf der Membran im Falle von Fehlern oder unvollständigen Transfers.

Kolorimetrischen Nachweis

Die kolorimetrische Nachweisverfahren hängt von der Inkubation der Western-Blot mit einem Substrat, die mit dem Reporter-Enzym, das an den sekundären Antikörper gebunden ist, reagiert. Dieser wandelt das löslichen Farbstoff in eine unlösliche Form in einer anderen Farbe, die neben dem Enzym ausfällt und dadurch färbt die Membran. Entwicklung des Blots wird dann durch Wegwaschen der lösliche Farbstoff gestoppt. Protein-Ebene durch Densitometrie oder spektrophotometrisch ausgewertet.

Chemilumineszenznachweis

Chemilumineszenten Detektionsverfahren hängen von der Inkubation der Western-Blot mit einem Substrat, das zur Lumineszenz wird bei dem Reporter an dem sekundären Antikörper ausgesetzt. Das Licht wird dann durch die CCD-Kameras, die Abscheidung eines digitalen Bildes, der Western-Blot oder photographischen Film nachgewiesen. Die Verwendung von Film für Western-Blot-Nachweis wird langsam wegen der Nichtlinearität des Bildes verschwinden. Das Bild wird durch Densitometrie, die die relative Menge der Proteinfärbung bewertet und quantifiziert die Ergebnisse in Bezug auf die optische Dichte analysiert. Neuere Software können weitere Datenanalyse, wie Molekulargewichtsanalyse gegebenenfalls Standards verwendet werden.

Die wichtigsten Unternehmen, die Chemilumineszenz Bildgebungssysteme sind SynGene, Azure Biosystems, UVItec, GE und Biorad.

Radioaktive Erkennung

Radioaktive Markierungen erfordern keine Enzymsubstrate, sondern ermöglichen die Platzierung der medizinischen Röntgenfilm direkt gegen den Western-Blot, entwickelt, die, wie es auf das Etikett ausgesetzt wird, und erzeugt dunkle Bereiche, die an die Proteinbanden von Interesse entsprechen. Die Bedeutung der radioaktiven Erkennungen Verfahren wird wegen seiner gefährlichen Strahlen rückläufig, weil es sehr teuer ist, sind Gesundheits- und Sicherheitsrisiken hoch und ECL bietet eine sinnvolle Alternative.

Fluoreszenzdetektion

Die fluoreszenzmarkierten Sonde durch Licht, wie etwa eine CCD-Kamera mit entsprechender Emissionsfiltern ausgestattet, die ein digitales Bild der Western-Blot, wie Molekulargewichtsanalyse und einfängt und ermöglicht eine weitere Datenanalyse angeregt und die Emission von der Erregung wird durch einen Photosensor detektiert eine quantitative Western-Blot-Analyse. Fluoreszenz wird als eines der besten Methoden für die Quantifizierung, ist aber weniger empfindlich als Chemilumineszenz.

Sekundär Sondieren

Ein Hauptunterschied zwischen Nitrocellulose und PVDF-Membranen betrifft die Fähigkeit jedes zur Unterstützung der "Stripping" Antikörper ab und Wiederverwendung der Membran für die anschließende Antikörpersonden. Zwar gibt es gut etablierte Protokolle zum Abisolieren Nitrozellulosemembranen zur Verfügung, ermöglicht die robusteren PVDF zur leichteren Abstreifen und für mehr Wiederverwendung vor dem Hintergrundrauschen begrenzt Experimenten. Ein weiterer Unterschied ist, dass, im Gegensatz zu Nitrocellulose, PVDF ist in 95% Ethanol, Isopropanol oder Methanol, vor der Verwendung eingeweicht werden. PVDF-Membranen neigen auch dichter und widerstandsfähiger gegen Beschädigungen während der Benutzung zu sein.

2-D-Gelelektrophorese

2-dimensionale SDS-PAGE verwendet, die Prinzipien und Techniken, die oben beschrieben. 2-D SDS-PAGE, wie der Name andeutet, beinhaltet die Migration von Polypeptiden in 2 Dimensionen. Beispielsweise in der ersten Dimension, Polypeptide werden nach isoelektrischen Punkt getrennt, während in der zweiten Dimension werden Polypeptide nach ihrem Molekulargewicht getrennt. Der isoelektrische Punkt eines gegebenen Proteins wird durch die relative Anzahl von positiv und negativ geladenen Aminosäuren mit negativ geladenen Aminosäuren Beitrag zu einem niedrigen isoelektrischen Punkt und positiv geladene Aminosäuren zu einer hohen isoelektrischen Punkt bestimmt. Proben können auch zunächst unter reduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE und unter reduzierenden Bedingungen in der zweiten Dimension, die neben Disulfidbindungen, die Untereinheiten zusammenzuhalten bricht getrennt werden. SDS-PAGE kann auch mit Harnstoff-PAGE für eine 2-dimensionale Gel gekoppelt werden.

Im Prinzip ermöglicht diese Methode für die Abtrennung aller zellulären Proteine auf einem einzigen großen Gel. Ein wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es unterscheidet häufig zwischen verschiedenen Isoformen eines bestimmten Proteins - zB ein Protein, das phosphoryliert ist. Proteine, die getrennt worden sind, kann aus dem Gel ausgeschnitten und dann durch Massenspektrometrie, die das Protein identifiziert, analysiert.

Bitte lesen Sie Artikel für Beispiele der Anwendung von 2-D-SDS-PAGE-Referenz.

Medizinische diagnostische Anwendungen

Der Zweit HIV-Test verwendet einen Western Blot Anti-HIV-Antikörpers in einer Probe von menschlichem Serum zu detektieren. Proteine, die von bekannten HIV-infizierten Zellen werden wie oben getrennt und auf eine Membran geblottet. Dann wird die zu testende Serum wird in den primären Antikörper Inkubationsschritt verwendet werden; freien Antikörper wird durch Waschen entfernt, und eine sekundäre Anti-Human-Antikörper an ein Enzym gebunden Signal hinzugefügt wird. Die gefärbten Banden zeigen dann die Proteine, an die das Patientenserum enthält Antikörper.
Eine Western-Blot wird auch als die definitive Test für Bovine spongiforme Enzephalopathie verwendet.
Einige Formen der Lyme-Krankheit-Tests verwenden Western Blotting.
Western-Blot kann auch als Bestätigungstest für Hepatitis-B-Infektionen verwendet werden.
In der Veterinärmedizin ist Western-Blot manchmal verwendet, um FIV + Status bei Katzen zu bestätigen.