Fluoreszenzanisotropie ist das Phänomen, bei dem Licht, das von einem Fluorophor emittiert wird, ungleich Intensitäten entlang verschiedener Achsen der Polarisation. Frühe Pioniere auf dem Gebiet gehören Aleksander Jablonski, Gregorio Weber und Andreas Albrecht. Die Prinzipien der Fluoreszenzpolarisation und einige Anwendungen des Verfahrens sind in Lakowicz Buch dargestellt.

Prinzip

Der Fluoreszenz, ein Molekül absorbiert ein Photon und wird auf einen höheren Energiezustand angeregt. Nach einer kurzen Verzögerung, kommt es zu einem niedrigeren Zustand verlieren einen Teil der Energie als Wärme und Emittieren der Rest der Energie als ein weiteres Photon. Die Erregung und Entregung beinhalten die Umverteilung von Elektronen über das Molekül. Daher kann die Anregung durch ein Photon nur auftreten, wenn das elektrische Feld des Lichts in einer bestimmten Achse, um das Molekül orientiert. Außerdem wird das emittierte Photon eine spezifische Polarisation in Bezug auf die Molekül.

Wenn polarisiertes Licht auf eine Gruppe von zufällig orientierten Fluorophore angewendet, werden die meisten der angeregten Moleküle diejenigen innerhalb eines bestimmten Bereichs von Winkeln zu der angelegten Polarisationsorientiert sein. Wenn sie nicht bewegen, wird das emittierte Licht auch in einem bestimmten Bereich quer zur angewandten Licht polarisiert sein. Diese intrinsische Anisotropie ist in der Regel durch die Einbettung der Fluorophor in einem gefrorenen Polyol gemessen.

Wenn die Fluorophore ihre Orientierung vor dem erneuten Aussenden der Photonen frei zu ändern, wird der Polarisationsgrad des emittierten Lichts verringert werden. Der Grad der Dekorrelation in der Polarisation des einfallenden und emittierten Lichts abhängt, wie schnell das Fluorophor Orientierung im Vergleich zur Fluoreszenzlebensdauer wird verwürfelt. Die Verwürfelung von Orientierungen durch das ganze Molekül Taumeln oder durch die Drehung von nur dem fluoreszierenden Teil auf. Die Rate der Taumeln auf die Maßnahme Anisotropie durch die Beziehung bezogen werden:

Wobei r die beobachtete Anisotropie ist r0 die intrinsische Anisotropie des Moleküls ist die Fluoreszenzlebensdauer und die Rotationszeitkonstante.

Diese Analyse ist nur gültig, wenn die Fluorophore sind relativ weit voneinander entfernt. Wenn sie sehr nahe beieinander sind, können sie Energie durch FRET auszutauschen und weil die Emission von einem der vielen unabhängigen Bewegen Moleküle führt dies zu einer geringeren als erwarteten Anisotropie oder eine größere Dekorrelation auf. Diese Art von homotransfer Förster-Resonanzenergietransfer wird als Energiemigration FRET oder emFRET

Anwendungen

Fluoreszenzanisotropie kann verwendet werden, um die Bindungskonstanten und die Kinetik der Reaktionen, die eine Änderung in der Drehzeit der Moleküle führen zu messen. Wenn das Fluorophor an ein kleines Molekül gebunden ist, kann die Rate, mit der es fällt signifikant verringern, wenn sie fest an ein großes Protein gebunden. Wenn das Fluorophor an der größeren Protein in einem Bindungspaares angebracht ist, wird der Unterschied in der Polarisation zwischen gebundenen und ungebundenen Zuständen kleiner sein und die Messung weniger genau. Der Grad der Bindung wird unter Verwendung der Differenz in der Anisotropie der teilweise gebundenen, freien und vollständig gebundene Zustände durch Titration der beiden Bindungspartner gemessen wird.

Wenn das Fluorophor an ein relativ großes Molekül wie ein Protein oder eine RNA gebunden ist, kann die Änderung der Mobilität begleitenden Faltung verwendet werden, um die Dynamik der Faltung zu untersuchen. Dies liefert ein Maß für die Dynamik, wie das Protein seine endgültige stabile 3D-Form erreicht.

Fluoreszenzanisotropie wird auch Mikroskopie angewandt, unter Verwendung von Polarisatoren in dem Weg des Beleuchtungslichts als auch vor der Kamera. Dies kann verwendet werden, um die lokale Viskosität des Zytosol oder Membranen zu studieren, wobei letztere die Informationen über den Membranmikrostruktur und der relativen Anteile der verschiedenen Lipide werden. Diese Technik wurde auch verwendet, um die Bindung von Molekülen an ihre Partner in Signalkaskaden in Reaktion auf bestimmte Signale zu detektieren.

Das Phänomen der emFRET und die zugehörige Abnahme der Anisotropie bei enger Wechselwirkung zwischen Fluorophoren auftreten wurde verwendet, um die Aggregation von Proteinen in Antwort auf Signalisierungs studieren.